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Evolutionäres Proteindesign

von Wolfgang B. Lindemann

Studium Integrale Journal
16. Jahrgang / Heft 1 - Mai 2009
Seite 43 - 45


Zusammenfassung: Ein wichtiger angenommener evolutiver Mechanismus zur Neuentstehung von genetischer Information soll die Verdoppelung eines Ausgangsgens mit anschließenden Mutationen in einem der beiden resultierenden Gene sein. Während die ursprüngliche Funktion durch ein unverändertes Gen aufrechterhalten wird, kann das andere Gen als „Spielwiese der Evolution“ ohne Schaden für den Gesamtorganismus mutieren. Eine schwedische Arbeitsgruppe hat jetzt ein solches Szenario experimentell an einem Escherichia coli-Protein nachzustellen versucht.




Einleitung

INach gängigen evolutionären Vorstellungen soll die „Neukombination“ von Genabschnitten (Gen-„Shuffling“) die Entstehung von neuen Proteinen ermöglichen. Ein solches neues Protein kann dann durch weitere Mutationen und Selektion optimiert werden. Andere Forscher weisen dagegen auf das Fehlen plausibler mechanistischer Vorstellungen hin, wie selbst unter der Voraussetzung von Gen-Shuffling auf molekulargenetischer Ebene tatsächlich neue Proteine aus dem bisher Vorhandenen entstanden sein könnten (z.B. Behe 2007, 145-158). Zu dieser bisher offenen Frage hat eine Arbeitsgruppe um den renommierten Stockholmer Bioinformatiker Gunnar von Heijne mit einer Publikation in der Fachzeitschrift Science eine interessante Studie vorgelegt.

Abb. 1: Veränderung des EmrE-Wildtyps mit dualer Topologie in zwei gegensätzlich in der Membran orientierten Proteine. Schwarze Kreise zeigen positiv geladene Aminosäurereste in den Schleifen zwischen den Transmembranhelizes, weiße Kreise zeigen zusätzlich hinzugefügte positive Reste in den beiden gegensätzlich veränderten Proteinen. (Nach Rapp et al. 2007)

Die Proteine der „Multiresistenz-Familie gegen kleine chemische Giftstoffe“ (Small multiple-drug resistence family oder SMR-Familie) machen das Darmbakterium Escherichia coli resistent gegen vielerlei chemische Stoffe, die aus kleinen Molekülen bestehen. Die Schutzproteine befinden sich in der äußeren Membran. Sie pumpen dort die schädlichen Moleküle aus der Bakterienzelle. Eines dieser Proteine ist z. B. EmrE, welches das Wachstum in Gegenwart des Giftstoffes Ethidiumbromid ermöglicht. Es besteht aus zwei (oder mehr) identischen Einzelbausteinen, die in der Membran abwechselnd in jeweils umgekehrter Orientierung angeordnet sind: Ein Einzelbaustein besitzt vier schraubenförmige Bereiche (Helices), die einmal mit dem „Kopf und Schwanz“ nach außen und ein anderes Mal mit „Kopf und Schwanz“ nach innen ragen.

Normalerweise wird die Anordnung von Proteinen in einer Membran durch die „Positiv-Innen-Regel“ (positive inside rule) vorhergesagt: Oft liegen zwischen zwei schraubenförmigen Bereichen Proteinbausteine, die positiv geladen sind (es handelt sich um die Aminosäuren Lysin und Arginin). Diese positiv geladenen Bereiche kommen üblicherweise innerhalb der Zelle zu liegen. Bei EmrE gibt es aber keinen besonders positiv geladenen Bereich. Das ist bei diesem Protein mit der zweifachen Einbaurichtung auch zu erwarten, da es hinsichtlich seiner Orientierung nicht festgelegt ist. Das EmrE-Protein von E. coli wird demzufolge nur von einem Gen kodiert, denn dieses Protein kann – wie gesagt – beide Richtungen einnehmen und so eine funktionsfähige Pumpe bauen.

Bei anderen Lebewesen, auch bei Eukaryoten, gibt es weitere ähnliche Proteine aus der SMR-Familie. Sie bestehen allerdings aus zwei verschiedenen Untereinheiten, die dann in der Membran jeweils entgegengesetzt orientiert sind. Die beiden Gene für die beiden Untereinheiten liegen auf dem Erbgut nebeneinander. Diese Anordnung soll evolutionär aus einem Protein mit einer unbestimmten Einbaurichtung, wie des EmrE aus E. coli, entstanden sein – das Gen habe sich verdoppelt (Genduplikation) und anschließend sollen sich Mutationen in den beiden resultierenden Proteinen angehäuft haben, die durch Austausch anderer Aminosäuren hin zu positiv geladenen die gegensätzliche Orientierung der beiden Untereinheiten in der Membran fixierten (vgl. Abb. 1). Nach weiteren hypothetischen Evolutionsschritten fusionierten diese beiden Einzelgene und bildeten ein neues Protein, welches nun insgesamt acht schraubenförmige Bereiche besitzt, da es aus zwei Proteinen mit je vier Schrauben hervorgegangen ist.

Beispiele wie Acanthostega kann man durchaus als „Zwischenformen“ ansprechen. Damit ist aber nicht gesagt, dass es sich auch um evolutionäre Übergangsformen handelt. Erstens: Eine Zwischenform ist umso besser als Übergangsform interpretierbar, je besser das gesamte Merkmalsspektrum zu einer solchen Stellung passt (vgl. Abb. 2). Es genügt nicht, nur einzelne Merkmale zu vergleichen und ggf. eine intermediäre Ausprägung festzustellen. Wenn andere Merkmale einer Position als Übergangsform widersprechen, ist diese Deutung insgesamt fraglich. Zweitens entsprechen Zwischenformen zunächst einmal „Übergangsökologien“ (vgl. Heilig 2009). Das heißt, es ist schon aus ökologischen Gründen verständlich, dass Fische, die in einem Uferbereich mit einer bestimmten (inzwischen ausgestorbenen) Vegetation leben, tetrapodenähnliche Merkmale besitzen.

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Simulation im Labor

Die Arbeitsgruppe von Heijne wollte dieses hypothetische evolutionäre Szenario im Labor nachstellen (und zugleich die bis dato noch nicht völlig bewiesene zweifache Einbaurichtung von EmrE bestätigen). Die Arbeitsgruppe veränderte den Gehalt positiv geladener Aminosäuren der innen bzw. außen liegenden Schleifen des EmrE-Proteins und beobachtete das Wachstum von E. coli in einem Nährmedium mit Ethidiumbromid. Bakterien ohne das EmrE-Gen wuchsen in diesem Medium nicht, im Gegensatz zu solchen Bakterien, die das intakte EmrE-Gen erhalten hatten. Dann veränderten die Forscher das ursprüngliche Gen: Die neue EmrE-IN-Variante wurde so konzipiert, dass „Kopf und Schwanz“ stets innerhalb der Zelle lagen. Dazu wurden 3 Aminosäuren verändert, wovon eine jetzt positiv geladen war. Eine zweite, EmrE-OUT Variante hatte entsprechend ihre „Kopf und Schwanz“-Region stets außerhalb der Zelle, auch bei ihr waren drei Aminosäuren verändert. Zusätzlich waren die beiden künstlichen Varianten mit Fluoreszenzmarkern gekennzeichnet, mit deren Hilfe ihre tatsächliche Orientierung in der Membran ermittelt werden konnte. Wenig überraschend wuchsen E. coli, die entweder nur EmrE-IN oder nur EmrE-OUT erhalten hatten, nicht in Gegenwart von Ethidiumbromid. Die erzwungene Einbaurichtung verhinderte den Bau einer funktionellen Pumpe, da abwechselnd IN- und OUT-Protein benötigt werden. Bakterien, die aber beide Gene für EmrE-IN und EmrE-OUT erhalten hatten, konnten eine funktionsfähige Giftpumpe bauen und damit in Gegenwart von Ethidiumbromid wachsen.

Die Veränderungen wurden gezielt
an einem geeigneten bereits vorhandenen Gen durchgeführt, was nicht ohne
weiteres als Modell für natürliche
Vorgänge gelten kann.

Die Aminosäure an 14. Stelle ist beim unveränderten natürlichen Protein am Transport des Ethidiumbromids entscheidend beteiligt. Eine Ersetzung dieser Aminosäure des natürlichen Proteins durch irgendeine andere Aminosäure macht den Transporter funktionslos. Doch die Gruppe von Heijne fand heraus, dass in beiden künstlichen Varianten, EmrE-IN oder EmrE-OUT, der Austausch der 14. Aminosäure durch eine andere (Asparagin) ohne wesentliche Funktionsverluste der „gemischten“ Pumpe aus EmrE-IN und -OUT möglich ist (sofern die 14. Aminosäure in der jeweils anderen Variante erhalten bleibt).

Heijne und Mitarbeiter sehen ihre Experimente als eine Nachahmung eines evolutionären Weges: Ein Protein mit einer zweifachen Einbaurichtung könne durch Genduplikation zu einem Paar gegensätzlich orientierter Tochterproteine evolvieren. Nach der Duplikation sammeln sich in einem der beiden Tochtergene weitere Mutationen an, die im ursprünglichen Protein zu Funktionsunfähigkeit geführt hätten, jetzt aber auf die Funktion keinen Einfluss mehr haben. Bei einem so problemlosen evolutionären Ablauf sei es nicht verwunderlich, dass viele Membranproteine Zeichen von Genduplikation und innerer Symmetrie zeigten.

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Kritische Anmerkungen

Kritisch ist anzumerken, dass Heijne keine Angaben über die Wahrscheinlichkeit eines solchen evolutionären Geschehens macht. Von den 121 Aminosäuren des EmrE wurden in dieser Arbeit gezielt drei verändert. Dass die Veränderung der natürlicherweise wichtigen 14. Aminosäure in der gemischten Pumpe aus den beiden veränderten Proteine EmrE-IN bzw. Emr-OUT toleriert werden kann, zeigt noch nicht, dass dies tatsächlich auch zu einem neuen, besseren oder mit einer anderen Funktion versehenen Protein führen könnte. Nach der Veränderung werden nun sogar zwei Gene statt nur einem benötigt. Es wäre zu prüfen, ob die künstlich eingeführten Veränderungen auch unter natürlichen Bedingungen einen Überlebensvorteil bringen und damit selektierbar sind.

Es wäre denkbar, dass durch das hier beschriebene Geschehen – welches aber im Bereich der Mikroevolution verbleibt, denn die Pumpe entsteht nicht de novo – eine Zelle eine Resistenz gegen ein neues Molekül anstatt Ethidiumbromid erwirbt. Zu schließen, hier liege nun der Beweis vor, dass durch Genduplikation entstandene Tochterproteine durch weitere Mutationen fast beliebig verändert werden könnten, wäre vermutlich eine Überinterpretation. Eine weitergehende Beurteilung erforderte Experimente, die Wahrscheinlichkeiten für eine selektierbare Veränderung angeben würden. Heijnes Arbeit ist ein wichtiger Schritt in diese Richtung, der aber nicht überinterpretiert werden sollte. Die Konstruktion von Proteinen mit neuer Funktion ist bislang nicht gelungen, die erfolgreiche Abänderung von Vorhandenem zeigt etwas von der dem Leben innewohnenden Flexibilität (vgl. Leisola & Turunen 2007). Zudem wurden die Veränderungen gezielt an einem geeigneten bereits vorhandenen Gen durchgeführt, was nicht ohne weiteres als Modell für natürliche Vorgänge gelten kann.

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Literatur

Behe MJ (2007)
Darwins Black Box. Biochemische Einwände gegen die Evolutionstheorie. Gräfelfing.
Leisola M & Turunen O (2007)
Protein engineering: opportunities and challenges. Applied microbiology and biotechnology 75, 1225-1232.
Rapp M, Seppäla S, Granseth E & Heijne G (2007)
Emulating membrane protein evolution by rational design. Science 315, 1282-1284.

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