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Konstitution von Nucleinsäuren: Hinweise auf funktionelle Optimierung

von Torsten Rossmann

Studium Integrale Journal
7. Jahrgang / Heft 1 - April 2000
Seite 36 - 39



Inhalt:

Zu den bedeutsamsten Makromolekülen in lebenden Zellen gehören die Nucleinsäuren (DNA und RNA). Sie sind Träger der Erbinformation und bilden lange Ketten, die aus einem Zucker, einer Phosphorgruppe und aus vier verschiedenen Stickstoffbasen zusammengesetzt sind (Abb. 1).


Abb. 1

Abb. 1

Abb. 1: Schematisierter Ausschnitt aus der Doppelhelix der DNA (oben). Die vier Stickstoffbasen sind durch vier verschiedene Kastensymbole dargestellt. Je zwei sind durch Wasserstoffbrücken verbunden (unten für Thymin und Adenin gezeigt: Punktierung) und bilden eine Sprosse der "DNA-Leiter". Das Strangrückgrat (abwechselnd aus einem Zucker und einer Phosphorgruppe bestehend) ist bandförmig dargestellt. Der Zucker wird durch Punkte am Strangrückgrat symbolisiert, dazwischen sind die Phosphorgruppen zu denken. Diese Teile wurden experimentell durch andere Verbindungen ersetzt und die chemischen Eigenschaften der Produkte mit natürlicher DNA verglichen.


In den letzten Jahren wurden eine Reihe derivatisierter bzw. nicht-natürlicher Nucleinsäure-Analoga synthetisiert und getestet. Zweck dieser Synthesen war die Erprobung ihres Einsatzes in der Therapie von Krankheiten.1

Diese Modifikationen umfassen u. a.:

  • Veränderung der Internucleosidbrücken: Phosphodiester => Methylphosphonate, Phosphoramidate, Phosphorothioate, Hydroxylamine;
  • Veränderung der Zuckerkomponenten: Ribose => diverse Hexo- bzw. Pentopyranosen; 3'-5'-carbocyclisch verbrückte Derivate der 2'-Deoxyribose (Steffens & Leumann 1997);
  • Austausch des Strangrückgrats: Polyesterketten auf Basis von Zucker-Phosphat-Einheiten => Carboxamidketten auf Basis von Aminosäurederivaten wie N-(2-Aminoethyl)-glycin-Einheiten. (Zur Orientierung s. Abb. 3)

Damit erfolgt ein kompletter Wechsel der zugrundeliegenden präparativen Arbeiten weg von Nucleosidchemie und hin zu Peptidchemie.2

In diesem Beitrag soll der Frage nachgegangen werden, ob und ggf. inwiefern die künstlich hergestellten Nucleinsäuren den natürlich vorkommenden überlegen sind. Dazu wird zunächst dargestellt, welche Umbauten an der natürlichen DNA bzw. RNA vorgenommen werden und in welcher Weise sich deren chemische Eigenschaften verändern. Diese Änderungen werden anschließend daraufhin bewertet, ob sie im Zellbetrieb gegenüber den natürlichen Nucleinsäuren vorteilhaft wären.


PNA-Chemie


Abb. 2Abb. 2: Strukturvergleich von PNA und DNA (verändert nach Egholm et al. 1993)

Im Falle des Austausches des Strangrückgrats handelt es sich um nicht-natürliche Peptid- oder Polyamid-Nucleinsäuren (PNA), deren Nucleobasen-tragendes Peptid-Rückgrat jedoch strukturell dem Nucleobasen-tragenden Zucker-Phosphat-Rückgrat natürlicher Polynucleotide ähnlich sein muß (Nielsen et al. 1991; Egholm et al. 1993). Der Strukturvergleich zwischen beiden Nucleinsäure-Arten ist in Abb. 2 dargestellt. Es konnte gezeigt werden, daß PNA:DNA- und PNA:RNA-Wechselwirkungen auf der H-Brücken-vermittelten Basenpaarung nach Watson-Crick beruhen (A::T; G:::C). CD-Spektren (CD = Circular-Dichroismus = Drehung der Schwingungsebene von eingestrahltem polarisierten Licht durch optisch aktive Makromoleküle von planar zu zirkulär oder elliptisch) weisen auf ähnliche Paarungsstrukturen bei antiparalleler Basenpaarung hin. Während die Geschwindigkeit für PNA:DNA-Hybridisierungen (Doppelstrangbildungen) der von reinen DNA: DNA-Hybridisierungen vergleichbar ist (ca. 106 M-1 sec-1), ist die Stabilität von PNA:DNA- bzw. PNA:RNA-Hybriden (Doppelstränge) größer als die korrespondierender DNA:DNA- bzw. DNA:RNA-Hybride (Egholm et al. 1993). Dies belegen Schmelzpunktbestimmungen (Tm) mit verschiedenen Oligomeren (Tm = melting temperature, Schmelzpukt = die Temperatur, bei der 50% der Hybride in Einzelstränge dissoziiert sind). Dabei wid die Absorptionsänderung bei 260 nm in Abhängigkeit von der Temperatur gemessen. So lauten die experimentell bei pH 7 und 0,11 M Na(+)-Ionen ermittelten Daten für die komplementär-antiparallele Hybridisierung des 15-mers TGTACGTCACAACTA (Orientierung: PNA = N->C, entspricht DNA / RNA = 5'->3') mit dem korrespondierenden Gegenstrang bei 4 µmol/l für jeweils beide Bindepartner:

    69,5 °C (PNA:DNA),
    72,3 °C (PNA:RNA),
    53,3 °C (DNA:DNA) und
    50,6 °C (DNA:RNA).

Je höher der Schmelzpunkt Tm liegt, desto stabiler ist der Doppelstrang.

Für die 10-mer-Oligonucleotide GTAGATCACT bzw. AGTGATCTAC (die PNA endet hier C-terminal mit einem Lysinamid) wurden für die komplementär-antiparallele Doppelstrangbildung mit dem jeweiligen Gegenstrang folgende Tm-Werte ermittelt:

    51,0 bzw. 49,0 °C (PNA:DNA) und
    33,5 bzw. 33,5 °C (DNA:DNA).

Andererseits ist aber die Abnahme an Stabilität der Hybride (Doppelstränge) im Falle von Fehlpaarungen in der Oligomer-Sequenz, erkennbar am Absinken der Schmelztemperatur Tm, bei PNA:DNA-Hybriden stärker ausgeprägt als bei DNA:DNA-Hybriden, d.h. die Unterscheidungsmöglichkeit zwischen korrekten und fehlerhaften Basenpaarungen (Diskriminierungsschärfe) ist bei PNA-DNA-Hybriden besser. So sinkt z.B. Tm für das Hybrid aus TGTACGTCAAACTA (5' => 3' bzw. N => C) und ACATGCAGTTTGAT (3' => 5') im Falle von PNA um 10-12 °C, wenn A gegen G, C, oder T ausgetauscht wird, im Falle von DNA hingegen nur um 5-11 °C (Egholm et al. 1993).3

PNA-Chemie findet auch Beachtung bei Fragen zum Ursprung der genetischen Information (Nielsen 1999), da (1) Aminosäuren in Ursuppen-Simulationsexperimenten verhältnismäßig einfach synthetisiert werden, insbesondere auch Glycin (Zubay 1983), die einfachste in Proteinen vorkommende Aminosäure. (2) Daraus könnte durch Polykondensation ein achirales (d.h. ohne optisch aktive Asymmetriezentren) und somit stereochemisch weniger anspruchsvolles Rückgrat entstehen. (3) Dieses weist gegenüber RNA eine erhöhte chemische Stabilität auf, und dies (4) bei hoher Affinität und Spezifität der Basenpaarung. Die präbiotische Synthese von PNA ist wie die Synthese von RNA mit offenen Fragen verbunden, auf die in diesem Beitrag jedoch nicht eingegangen wird.


Basenpaarungsstärken bei anderen DNA-Derivaten

Überraschenderweise findet man gegenüber RNA erhöhte Basenpaarungsstärke auch mit Derivaten, die viel näher am Naturstoff sind als PNA (Steffens & Leumann 1997; Beier et al. 1999).


Abb. 3: Strukturvergleich der betrachteten Pentopyranosyl-(2 ->4 )-Oligonucleotide untereinander und mit natürlichem D-Ribofuranosyl-(3 ->5 )-Oligonucleotid (verändert nach Beier et al. 1999).
Abb. 3

So fanden Beier et al., daß Vertreter der Pentopyranosyl-(2'->4')-Oligonucleotidfamilie (d.h. die Pyranosyl-Isomere der RNA, in denen der offenkettige Pentosezucker nicht zu einem 5-gliedrigen [Furan-Derivat], sondern 6-gliedrigen [Pyran-Derivat] Sauerstoff-Heterocyclus kondensiert ist) eine stärkere Watson-Crick-Basenpaarung mit antiparalleler Orientierung erlauben als die natürlich vorkommenden Ribofuranosyl-(3'->5')-Oligonucleotide, d.h. RNA. Diese in Abb. 3 dargestellte Familie enthält alle Pentopyranosyl-(2'->4')-Oligonucleotide, welche die Nucleobase in äquatorialer Stellung relativ zum Pyranosering tragen; es sind dies Oligo-β-Ribo-pyranoside, Oligo-b-Xylo-pyranoside, Oligo-α-Lyxo-pyranoside, und Oligo-α-Arabino-pyranoside. Alle sind stärker basenpaarend (d.h. haben eine höhere Affinität) als das natürliche Oligo-β-Ribo-furanosid. Am stärksten sind Oligo-α-Arabino-pyranoside, was mit den folgenden Strukturmerkmalen erklärt werden kann:

  • stark eingeschränkte Konformationsfreiheitsgrade der Phosphodiesterbrücke, da beidseits flankiert durch Substituenten in äquatorialer Stellung (Nucleobase und 3'-Hydroxylgruppe),
  • die Rigidität (Steifheit) des Pyranoseringes in Sesselkonformation,
  • in Verbindung damit die axiale Stellung der Phosphodiesterbrücke zwischen den Nucleosiden, an den 2'- bzw. 4'-OH-Gruppen ansetzend.

All dies unterstützt eine für Basenpaarungen günstige Konformation, was wiederum deutlich wird an den experimentell ermittelten Tm-Daten (0,15 M NaCl, pH 7,0, 10 µmol/l für die jeweils komplementären Stränge). Stellvertretend sind 2 Datensätze herausgegriffen:



Octamer-HybridPentopyranosylsystemTm [°C]

4'-AAAAAAAA-2'Oligo-β-Ribo-pyranosid40,0
2'-TTTTTTTT-4'Oligo-β-Xylo-pyranosid47,0
Oligo-α-Lyxo-pyranosid35,4
Oligo-α-Arabino-pyranosid71,1
4'-ATATATAT-2'Oligo-β-Ribo-pyranosid38,0
2'-TATATATA-4'Oligo-β-Xylo-pyranosid38,3
Oligo-α-Lyxo-pyranosid28,6
Oligo-α-Arabino-pyranosid60,0

Nun sind aber weder PNA noch Pyranosyl-RNA, noch Oligo-α-Arabino-pyranosid-Nucleotide im besonderen in der Natur zu finden, obwohl sie bezüglich bestimmter Aspekte wie Bindestärke der Basenpaarung (= Affinität) oder Erkennungsschärfe von Fehlpaarungen (= Spezifität) durchaus attraktiv erscheinen. Dies ist umso bemerkenswerter, als Aminosäuren in Ursuppen-Simulationsexperimenten synthetisiert worden sind (z.B.: Glycin 2,1% Ausbeute bezüglich des eingesetzten Kohlenstoffs), und in der für die Anlieferung von Zuckerkomponenten diskutierten sog. Formose-Reaktion (Zuckerbildung aus mehrfachen Reaktionen von Formaldehyd und Glycoaldehyd) z.B. Arabinose und Ribose mit ca. derselben Wahrscheinlichkeit gebildet werden können. Das heißt: Von hypothetischen Ursuppen ausgehend könnte man eine PNA-Chemie (oder eine nicht auf Ribose basierende RNA-Chemie) durchaus erwarten, sie ist aber nicht realisiert worden.


Schlußfolgerungen

Unter der Annahme eines komplexen Synthesegemisches ("Ursuppe") mit nachfolgender Auswahl von Bausteinen für Polymersynthesen nach funktionellen Kriterien bedeuten diese Befunde, daß nicht die Maximierung eines bestimmten physikochemischen Kriteriums die Triebfeder sein konnte, sondern vielmehr die Optimierung hin auf eine biochemische Funktion. So verlangen die biochemischen Prozesse von Informationsspeicherung und Informationsweitergabe (DNA-Replikation, DNA-Transkription in RNA) nicht eine maximale, sondern optimale Bindestärke der Basenpaarung, welche je nach Bedarf dynamische Assoziationsprozesse von Einzelsträngen (Doppelstrangbildung) oder Dissoziationsprozesse von Doppelsträngen (Trennung) erlaubt.

Optimierungsprozesse bedingen aber eine Zielvorgabe, davon abgeleitete Konzepte bzw. Programme, sowie geeignete Mechanismen und Werkzeuge zur Umsetzung derselben. All dies beinhaltet konzeptionelle Intelligenz ("Design"), und das ist das exakte Gegenteil von reinen Zufallsereignissen und Veränderungen, angestoßen durch ungerichtete energetische Schwankungen von Atomen und Molekülen.

Somit weist die Konstitution von Nucleinsäuren mindestens 3 Merkmale auf, die auf ein planvolles, konzeptionell sinnvolles Vorgehen deuten:

  • die absolute Selektivität bezüglich optisch aktiver Bausteine (hier D-(+)-Ribose), die schon Louis Pasteur Mitte des letzten Jahrhunderts als ein untrügliches Kennzeichen belebter Natur erkannte und den Polymerketten die helikale Verwindung und damit ihre biospezifische 3D-Konformation verleiht,
  • die statistische Co-polykondensation (Kettenbildung) von 4 verschiedenen Nucleosidphosphaten zu linearen Ketten mit trivalenter Phosphorsäure als Internucleosidbrücke, was ohne eine ausgefeilte und optimierte Synthesestrategie zu biochemisch unbrauchbaren Netzwerken und ohne präzise Reaktionskontrolle nicht zu biologisch sinnvollen Nucleobasensequenzen führt, sowie
  • die hier angesprochene Baustein-Auswahl nach biochemisch-molekularbiologischen Zielen, obwohl gerade die in lebenden Zellen vorkommenden chiralen linearen Ribofuranosyl-phosphodiester-Polymere präparativ außerordentlich anspruchsvoll sind.

Diese Befunde sind eine konkrete Anfrage, ob Hypothesen über eine spontane Entstehung einfacher Bausteine und daraus abgeleiteter Makromoleküle unter dem Regime rein physiko-chemischer Gesetzmäßigkeiten geeignet sind, um Entstehung und Erhalt der komplexen, hoch effizienten und zugleich fein ausbalancierten biochemischen Prozesse lebender Organismen zu erklären.



Anmerkungen

  1. Die Bemühungen zielen vor allem darauf ab, hochaffine Oligonucleotid-Therapeutica bereitzustellen (Hélène & Toulmé 1990) wie z.B. Antisense-Sonden, Genblocker, oder Triplexing-Agentien; die Affinität ist ein Maß für die Beständigkeit des Produktes einer reversiblen Komplexierungsreaktion.
  2. und zwar in puncto Edukte, Art der Schutzgruppen und Aktivierungsreagenzien, Kopplungsbedingungen, Entblockungsreagenzien und -bedingungen etc. (Egholm et al. 1992).
  3. Es wird versucht, beide Eigenschaften (Stabilität und Diskriminierungsschärfe) in sog. PNA-Arrays auszunutzen (Weiler et al. 1997). Hierzu werden PNA-Sonden mit unterschiedlicher Erkennungssequenz ortsaufgelöst an eine Festphase gebunden und mit Analyt-DNA / RNA inkubiert. Das aus dieser Parallelreaktion resultierende Hybridisierungsmuster gibt dann Aufschluß über die Sequenzcharakteristika des Analyten.


Literatur

  • Beier M, Reck F, Wagner T, Krishnamurthy R & Eschenmoser A (1999) Chemical etiology of nucleic acid structure: comparing pentopyranosyl-(2´-4´) oligonucleotides with RNA. Science 283, 699-703.
  • Egholm M, Buchardt O, Nielsen PE & Berg RH (1992) Peptide nucleic acids (PNA). Oligonucleotide analogues with an achiral peptide backbone. J. Am. Chem. Soc. 114, 1895-1897.
  • Egholm M, Nielsen PE, Buchardt O & Berg RH (1992) Recognition of guanine and adenine in DNA by cytosineand thymine containig peptide nucleic acids (PNA). J. Am. Chem. Soc. 114, 9677-9678.
  • Egholm M, Buchardt O, Christensen L, Behrens C, Freier S, Driver DA, Berg RH, Kim SK, Norden B & Nielsen PE (1993) PNA hybidizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogenbonding rules. Nature 365, 566-568.
  • Hélène C & Toulmé J-J (1990) Specific regulation of gene expression by antisense, sense and antigene nucleic acids. Biochim. Biophys. Acta 1049, 99-125.
  • Nielsen PE, Egholm M, Berg RH & Buchardt O (1991) Sequence selective recognition of DNA by strand displacement with thymine-substituted polyamids. Science 254, 1497-1500.
  • Nielsen PE (1999) Peptide nucleic acid. A molecule with two identities. Acc. Chem. Res. 32, 624-630.
  • Steffens R & Leumann CJ (1997) Tricyclo-DNA: A phosphodiester-backbone based DNA analog exhibiting strong comlementary base-pairing properties. J. Am. Chem. Soc. 119, 11548-11549.
  • Weiler J, Gausepohl H, Hauser N, Jensen ON & Hoheisel JD (1997) Hybridization absed DNA screening on peptide nucleic acid (PNA) oligomar arrays. Nucleic Acids Res. 25, 2792-2799.
  • Zubay G (ed, 1983) Biochemistry, Addison-Wesley Publishing Company.


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